SDS-PAGE

Roztoky:

I. Akrylamid / Bis-akrylamid

• 29.2 g akrylamidu
• 0.8 g bis-akrylamidu
• H₂O do 100 ml

II. 4 x Pufr pro separacni gel

• 75 ml 2 M Tris-HCl, pH 8.8
• 4 ml 10% SDS
• 21 ml H₂O

III. 4 x Pufr pro zavadeci gel

• 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 6.8
• 4 ml 10% SDS
• 46 ml H₂O

IV. 10 x Pufr pro elektroforesu (pred pouzitim naredit 10 x)

• 30 g Trisu
• 144 g glycinu
• 10 g SDS
• H₂O do 1 l

V. 5 x Pufr pro pripravu vzorku

• 0.6 ml 1 M Tris-HCl, pH 6.8
• 5 ml 50% glycerolu
• 2 ml 10 % SDS
• 0.5 ml 2-merkaptoethanolu
• 1 ml 1% bromfenolove modri
• 0.9 ml H₂O

Vypocet slozeni x% separacniho gelu:

Roztok I	x/3 ml
Roztok II	2.5 ml
H2O	(7.5 - x/3) ml
10% persulfat amon.	50 ul
TEMED	5 ul (10 ul pri x<8%)
Celkovy obem	10 ml

Kapacita bunek:

Sila gelu	1 bunka	5 bunek	10 bunek	15 bunek
0.5 mm	0.7 ml	45 ul	16 ul	9 ul
0.75 mm	1 ml	68 ul	24 ul	14 ul
1 mm	1.4 ml	90 ul	32 ul	18 ul
1.5 mm	2.1 ml	135 ul	48 ul	27 ul

Priprava vzorku:

Po naliti gelu (separacni gel polymeruj 60', zavadeci gel asi 30'):

• Smichat vzorek bilkoviny a 5 x Pufru pro pripravu vzorku (napr. 20 ul + 5 ul).
• Zahrat na 100 °C na 2-10'.
• Centrifugovat roztoky nekoli vterin v mikrocentrifuze.
• Nanest vzorky do bunek.

Nejbeznejsi koncentrace gelu:

Poznamky:

• Minimalni mnozstvi proteinu na bunku (drahu) je asi 0.1 ug (Coomassie staining) az 2 ng (silver staining).
• Maximalni mnozstvi proteinu na bunku je 20-40 ug.
• Pro odstraneni edge-efektu je nutno do prazdnych bunek nanest trochu 1 x Pufru pro pripravu vzorku.

Elektroforeza:

Parametry:

• U = 200 V
• I ~ 100 mA na startu a 60 mA na konci pro dva 0.75 mm gely
• I ~ 110 mA na startu a 80 mA na konci pro dva 1.5 mm gely

Barveni gelu

A. Pomoci Coomassie Blue R-250:

Roztoky:

I. Staining solution (1 l)

• 1 g Coomassie Blue R-250
• 450 ml methanolu
• 450 ml H₂O
• 100 ml konc. kyseliny octove

II. Destaining solution (1 l)

• 100 ml methanolu
• 100 ml konc. kyseliny octove
• 800 ml H₂O

Doba barveni ~ 30-60', odbarveni ~ 60-120'.

B. Barveni stribrem:

1. Fixace 40% MeOH, 10% kys. octova, 1 hodinu

2. Fixace 10% EtOH, 5% kys. octova, 2 x 15 min.

3. Oxidace: 0.06 g Na₂S₂O₃.5H₂O / 300 ml H₂O (cerstvy), 2 min.

4. Promyti H₂O, 3 x 20 s.

5. Barveni: 0.6 g AgNO₃ v 300 ml H₂O + 0.225 ml 37% formaldehydu, 20 min.

6. Promyti H₂O, 3 x 20 s.

7. Vyvolani: Na₂CO₃ (60 g/l), 0.5 ml 37% formaldehydu, Na₂S₂O₃.5H₂O (4 mg/l), 10-15 min.

8. STOP: 5% kyselina octova, 5-15 min.

9. Pred susenim 3% glycerol.